12实验十二植物细胞骨架的光学显微镜观察解析.ppt

实验12植物细胞骨架的光学显微镜观察 实验目的 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 实 验 目 的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术 实 验 原 理 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF， 5～7nm ）、微管（microtubule，MT，20～25nm）、中间纤维（intermediated filament，IF，8～11nm）。 细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。 细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、高压、锇酸处理，而且MF、MT、IF都是直径非常小的结构，只有在电镜下才能够观察到。 研究细胞骨架常规的实验方法： 电镜观察、组织化学、免疫荧光等 研究细胞骨架常规的实验方法 本实验采用的特殊方法 Triton X－100 Triton X－100是一种非离子型去垢剂，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束不会被Triton 破坏而保留在细胞中。 通过Triton的处理去掉了一部分杂蛋白，使细胞骨架显现更清晰。 M－缓冲液 成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCL2等 咪唑是一种缓冲剂；EDTA 、EGTA螯合Ca离子，保持一种低钙条件。 使骨架纤维保持在聚合状态并且较为舒张。 考马斯亮蓝R250 是一种普通的蛋白质染料，可以使细胞内各种蛋白质染色。 本实验中，有些骨架纤维不稳定，如微管；有些纤维太细，在光学显微镜下无法分辨。 在实验中观察到的纤维主要是微丝束，由许多微丝结合在一起，直径约在40nm左右，考马斯亮蓝R250染色对微丝束的显示起了夸大的作用。 仪器、材料与试剂 仪器：光学显微镜， 材料：洋葱鳞茎 试剂：磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH 7.4），.2mol/L 磷酸盐 缓冲液（pH 6.8），M-缓冲液，1％Triton X-100 （用M-缓冲液配），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制） 实 验 步 骤 1）撕取洋葱鳞茎内表皮约1cm2，放入盛有5 mL pH6.8的磷酸盐缓冲液的50mL小烧杯中，使其下沉（或浸没5min）。 2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100处理洋葱表皮20 min。（3mL） 3）吸去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约3 min。（3mL） 4）加3%戊二醛固定20min。（5mL） 5）用磷酸缓冲液洗3次，每次3min。（3mL） 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色20 min。（3mL） 7）用自来水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。 结果观察 将制好的片子置于光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成兰色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜继续观察，调节小镙旋可见到细胞骨架的立体结构。 注意事项 撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉。样本要展开铺平 去垢处理要掌握好时间和温度 染色时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色 观察时选择平展染色适中的部位观察 染色时统一到水槽旁边染色，不要污染桌面 滴加染液时要小心，不要使手上被染色了 实 验 报 告 画出所观察到的微丝图像。 * * ※ 完成实验后,将各自用的载玻片和盖玻片洗净,至酒精中. *