从生物样品中分离纯化生物大分子案例.ppt

从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 1. 确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求 2. 建立相应可靠的分析测定方法 3. 查阅文献调研和预备性实验 前期准备 * 前期准备 细胞破碎 分离纯化 提取鉴定 浓缩、干燥、保存 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * 细胞破碎 机械破碎 化学破碎 物理破碎 酶学破碎 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * 前期准备 细胞破碎 分离纯化 提取鉴定 浓缩、干燥、保存 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * * 分离纯化 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。 * 前期准备 细胞破碎 分离纯化 提取鉴定 浓缩、干燥、保存 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * 提取鉴定 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。 物理、化学方法： 比色法、气相/液相色谱法、 光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 但应注意，如果实验对精确性要求较高则必须同时采用 2-3 种不同的纯度鉴定法才能确定。 生物学的测定法： 酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 实验需要了解的理化性质 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时和冻干时的稳定性。 物理性质： 分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、 离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。 化学性质： 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力等。 离子交换柱层析法 电泳法 电荷性质的差异 分子大小形状差异 凝胶过滤法 超滤法 透析法 离心法 溶解度差异 分配层析 萃取 结晶 盐析 有机溶剂沉淀 选择性沉淀 沉淀法 生物功能专一性 亲和层析 * 前期准备 细胞破碎 分离纯化 提取鉴定 浓缩、干燥、保存 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * 浓缩、干燥、保存 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶液的过程。 干燥：把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。 干粉保存：0-4℃ 冰箱中保存即可（样品置于干燥器中）。 液态保存：0-4℃ 冰箱即可。不能放在0℃ 以下，因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。 * 比赛评委 分离纯化 细胞破碎 提取鉴定 前期准备 浓缩、干燥、保存 完成内容 从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线 * 比赛评委 从生物样品中分离纯化生物大分子——常见生物大分子分离纯化 * 分离纯化原则： 保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 具体原则：温度不要过高；控制pH值范围 pH值5-9 ; 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的机械剪切力。 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC 二乙基焦碳酸盐 ；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物 ② 分离纯化的步骤： 取材：核酸在细胞内部，所以需要破碎细胞才能取得核酸，常用方法如下：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法 SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等） 核酸的分离纯化 除杂： 肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死；加入淀粉酶；在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA。 蛋白质的除去：加入去污剂如SDS；氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提；苯酚水溶液抽提；加入浓盐溶液如NaCl。 不同类型核酸的分离：（1）从DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶选择地破坏RNA；钙盐分步沉淀；活性炭吸附。（2）从RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脱氧核糖核酸酶处理。 同类核酸的分离：（1）RNA混合物的分离：多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分离：常用磷酸钙