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生理所黄阿敏第一页，共四十页，2022年，8月28日 Comparison of Southern, Northern, and Western analyses of Gene X第二页，共四十页，2022年，8月28日 Southern hybridizationFirst described by E. M. Southern in 1975. Applications of Southern hybridizationRFLP’s, VNTR’s and DNA fingerprintingChecking of the gene knockout miceThe flow chart of Southern hybridization第三页，共四十页，2022年，8月28日 Southern hybridizationTransfer buffer第四页，共四十页，2022年，8月28日 Detection of an RFLP by Southern blotting第五页，共四十页，2022年，8月28日 Detection of the sickle-cell globin gene by Southern blotting第六页，共四十页，2022年，8月28日 Checking of the gene knockout mice第七页，共四十页，2022年，8月28日 Flow chart of Southern hybridizationPreparing the samples and running the gelSouthern transferProbe preparationPrehybridizationHybridizationPost-hybridization washingSignal detectionIsotopeNon-isotope第八页，共四十页，2022年，8月28日 Preparing the samples and running the gelDigest 10 pg to 10 ?g of desired DNA samples to completion.Prepare an agarose gel, load samples (remember marker), and electrophorese.Stain gel ethidium bromide solution (0.5 ?g/ml). Photograph gel (with ruler).第九页，共四十页，2022年，8月28日 Critical parameters (I)Note the complexity of DNAGenomic DNAA single-copy of mammalian gene, 3 Kb average in length 10 mg x 3 Kb/3 x 106 Kb = 10 mg x 1/106 = 10 pgPlasmid DNA or PCR products 0.1 mg of a 3 Kb plasmid DNA ?100 ng第十页，共四十页，2022年，8月28日 Gel treatmentAcid treatment 0.2 N HCl solution DenaturationNaOH solutionNeutralizationTris-Cl buffer (pH8.0)第十一页，共四十页，2022年，8月28日 Southern transferMeasure gel and set up transfer assembly: Wick in tray with 20x SSCGelNitrocellulose or Nylon filters (soaked in H2O and 20x SSC)3MM Whatman filter paperPaper towelsWeight第十二页，共四十页，2022年，8月28日 After Southern transferDissemble transfer pyramid and rinse nitrocellulose in 2x SSCBake nitrocellulose at 80?C for 2 hr or UV-crosslink Nylon membrane for seconds 第十三页，共四十页，2022年，8月28日 Preparation of probesSynthesis of uniformly labeled double-stranded DNA probesPreparation of single-stranded probesLabe